酶的存活性              

长时间反应时，内切酶的活性保持情况因酶而异。

+ + + 酶活性时间 ＞ 8 小时

+ +     酶活性时间 4-8 小时

+        酶活性时间 2-4 小时

–      不建议反应时间 ＞ 1 小时

大多数限制性内切酶常规酶切时间为 1 小时或更短。某些反应要求加入酶量 ＜ 1 单位/μg DNA 同时相应延长反应时间 ＞ 1 小时。下表可做为低酶量或反应时间延长时的操作指南。 

例如，1 单位 AatII 能在 16 小时温育后消化 8 μg DNA（+++）。

根据内切酶单位定义检测延时酶切活性，其中标准的 1 小时反应时间改为 16 小时。表中标注有“+++”的酶是能延时酶切的内切酶，这些酶 16 小时酶切 1 μg DNA 仅需 0.13 单位的酶量；表中标注有“++/+” 的酶是具有中等活性的延时内切酶，16 小时完全酶切 1 μg DNA 需要 0.25（++）或 0.50（+）单位的酶量；标注有“-”的酶，需要 1 单位才能达到完全酶切，与 1 小时反应时间需要的酶量一样。

超螺旋 DNA 的切割                

限制性内切酶对不同底物 DNA 切割效率不同。在标准反应条件下用质粒 pBR322、pUC19 和 pLITMUS 检测内切酶切割超螺旋质粒的能力。尽量先用每种质粒中的单一识别位点，当有多个数据时取其平均值，用 λDNA 作为阳性对照（所有情况下切割它所需酶量均为 1 个单位）。