美国Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技术作为新一代的RNA原位杂交技术，通过其专利的双Z探针设计原理以及信号级联放大系统，可以兼容由于空气中RNA酶对于RNA的部分降解导致一定程度的组织RNA缺损，从而达到对组织和细胞内的RNA进行高效的原位检测。

在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope对石蜡样本，新鲜冰冻和固定冰冻样本的组织切片进行原位杂交的过程中，经常会遇到各种各样的技术问题。前三期我们就样本制备，样本预处理的一些注意细节，以及问题样本预处理调整方案进行了探讨，本期继续就其他一些客户常见问题给大家提供一些相关小贴士。

在解决了样本制备和预处理问题后，客户还会遇到的一些RNAscope检测常见问题有：

1  掉片问题

掉片多见于石蜡样本和固定冰冻样本。说是多见，并不意味着这是一个普遍现象，通常按照ACD产品说明书里的样本制备方法进行的样本制备和其他标准流程操作，掉片现象并不常见。当发现实验中出现掉片现象时，可以通过以下几点进行调整：

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确保使用高粘附载玻片

与免疫组化不同，ACD的包括RNAscope, Basescope，miRNAscope等的操作流程相对较长，除前期预处理的三个主要步骤，探针杂交2小时以外，后续还要根据检测试剂盒的不同，有若干步Amp的孵育，直到最后显色（可见光或者荧光）。所以公司推荐使用高粘附的进口载玻片进行组织切片的粘附和后续检测。具体可选用的载玻片请参见说明书或直接与我公司的技术人员交流([email protected])。

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按照公司推荐的标准流程制备组织样本

具体的样本制备方法在前几期的软文以及公司产品说明书里都有描述，这里不再赘述。

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在进行贴片时尽量避免气泡，适当延长烤片时间

贴片时，当组织切片与载玻片间没有完全牢固贴合上，则会降低由于电荷间吸附力下降导致的空隙，在后续检测时，这些不牢固区域会导致掉片；石蜡切片建议在60℃烤箱烤1小时。在脱片的情况下，可以适当延长到1个半小时。而固定冰冻样本切片也可以通过增加烤片环节增加粘附（时间可以控制在60℃半小时）。

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对于石蜡切片和固定后冰冻切片，如果遵守上述操作后仍然有掉片问题，可以参考增加以下步骤进行操作。

石蜡切片可以在第一步烤片后或者target retrieval之后增加烤片环节，降低脱片问题（见上图）。

固定后冰冻切片可以在上图的I（-20℃低温干燥2小时），II（进行后固定），III（增加烤片60℃ 30分钟环节）和IV（去除煮沸步骤但是同时增加蛋白酶处理）环节进行相应调整。最终达到以下右图效果。

2  靶探针没有结果

在遇到这类问题时，第一时间需要确认样本的阳性对照探针（通常包括PPIB或者UBC）和阴性对照探针(DapB)结果如何。在众多此类问题中，有一多半的客户在确认了阳对和阴对探针结果后，都可以很好的回答靶探针没信号的问题。即由于样本本身制备过程中未按照标准流程，固定不充分，导致RNA大幅度降解，故无法检测到靶探针信号。

针对样本质量没有问题的客户，则可以与我们的技术人员联系（[email protected]），寻求进一步的帮助和指导。

3  特殊样本怎么办

在常规的样本外，经常会遇到客户使用的是包括类器官，骨骼样本以及血液等较为特殊的样本类型，对于这些种类的样本，有专门的样本处理和制备方法，可以帮助完成前期包括固定，脱钙，包埋等一系列问题，最终放置到载玻片上进行常规RNAscope, Basescope等检测。相关制备细节可参见本公众号之前发表的软文，或与我们的技术部门同事联系询问细节。

最后，在开始实验前注意以下环节，将有助于避免实验中的常见错误，保证整个实验的顺利进行。

下一期，我们将RNAscope荧光检测的一些常见问题进行探讨，与大家一起了解并加深荧光检测的操作细节和关键点。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：

应用广泛 

使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

特异性强

RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。

单分子可视化和单细胞定量

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。