负责我们认知、意识的神经活动主要发生于我们大脑内部，负责体表的一系列感觉有外周神经通路，而对于我们体腔内的内脏器官的感觉传入和神经支配，则主要由迷走神经完成。迷走神经负责的组织器官多样，功能也各不相同，但迷走神经核团是如何对各个内脏的传入信息进行区分和编码，目前了解的不甚清晰。不同器官传入的神经元涉及种类繁多，对不同刺激产生应答，了解不同类型神经元的空间分布及分类特点，对于理解信息如何编码汇聚非常重要。2022年3月，美国耶鲁大学医学院的常瑞实验室与张乐实验室合作在Nature上发表了一篇研究，通过使用RNAscope HiPlex结合单细胞测序、活体钙成像等技术，对迷走神经元进行了空间及细胞活动特征的研究^[1]。

作者先在小鼠不同器官内分别注射带有荧光标记和不同barcode的逆行AAV病毒，以此标记不同器官来源的迷走神经。然后分离出标记好的迷走神经元做单细胞测序，筛选总结出大量靶标，及不同靶标在每类神经元中的相对表达量。随后作者使用RNAscope HiPlex技术对筛选出的不同器官来源的迷走神经元中感兴趣靶标进行了原位验证，并将此方法称之为“Projection-seq” （图1）。在多个组织器官来源的迷走神经元中原位验证结果与单细胞测序结果匹配良好，且各靶标相对表达量与单细胞测序接近。

图1. Projection-seq验证肺脏投射来源不同亚群迷走神经元的靶标分布。

随后，作者在迷走神经元中泛表达钙指示剂GCamP6s，并在Gpr65阳性神经元中表达红色荧光蛋白指示剂，用于对神经元进行定位。通过对小鼠肺、食管、胃肠道等不同内脏器官或不同节段分别进行机械刺激，同时记录迷走神经元的钙反应情况，之后，再结合RNAscope HiPlex技术，对迷走神经元进行多靶标染色，通过红色荧光蛋白定位，将RNA原位信息与钙活动信息整合到一起。作者将此方法命名为“vCatFISH”。通过vCatFISH，得以让我们看到对于相同器官的同一刺激，会有表达不同基因的神经元产生反应，说明对于同样的刺激，在迷走神经元中也存在多个维度的编码。神经系统通过对不同维度信息进行整合，最终帮助我们实现对刺激强度、时间、位置等具体细节的区分，从而使机体对不同情况进行应对。而本篇文章的工作帮助我们未来对神经活动进行解码提供了一种新的选择和启发。

图2. vCatFISH技术揭示了对于机体不同刺激反应的神经元的基因特征。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：

应用广泛 

使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

特异性强

RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。

单分子可视化和单细胞定量

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

在RNAscope技术的基础上，ACD公司旗下的Basescope技术可以检测RNA水平的外显子跳跃，点突变，环状RNA等；miRNAscope可以原位对小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO进行追踪定位；而近年来推出的RNAscope HiPlex技术则可以在一张石蜡切片上同时检测最多12个RNA靶标的分布定位，成为神经科学，肿瘤微环境研究以及单细胞测序后验证等领域的常用检测方法。