酶切反应条件的优化         

当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如，如何在反应体系中加入适量的 DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。根据定义，在 50 μl 反应体系中，1 单位的限制性内切酶可以在 60 分钟内完全切割 1 μg 的底物 DNA。上述酶、DNA 与总反应体积的比值可以作为建立反应体系的参考数据。但是，目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件，使用 5-10 倍过量酶切 DNA，这样有利于克服由于 DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的不利因素。省时反应体系用于带有 Time-Saver 标记的限制性内切酶，省时内切酶可以在 5-15 分钟切割 DNA。此外，RE-Mix 限制性内切酶预混液也可以使用。NEB 整理了以下有关内切酶反应的经验和技巧，以帮助您实现最佳酶切效果。

标准反应体系：
限制性内切酶                      10 units*
DNA                                   1 µg                            
10X NEBuffer                       5 µl (1X)
总反应体系           50 µl        
温育温度         因酶而异              
温育时间           60 分钟
*足够切割所有类型的 DNA。

省时酶切反应体系：
限制性内切酶          1 µl
DNA                                         1 µg
10X NEBuffer                          5 µl (1X)
总反应体系              50 µl
温育温度            因酶而异
温育时间         5-10 分钟*
 *具有省时酶切特性的内切酶也可以过夜反应而没有星号活性。

内切酶

•  从冰箱取出后请一直置于冰上。

•  酶最后加入到反应体系中。

•  加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。切忌振荡混 匀。

•  一般情况下，我们推荐使用 5-10 单位酶量/μg DNA，基因组 DNA 用 10-20 单位酶量消化 1 小时。

•  NEB 推出一系列的高保真（HF^TM）内切酶，为建立酶切反应体系提供了更多便利，有关高保真酶的更多信息。

DNA

•  避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。推荐在纯化过程中多清洗几次。

•  甲基化的 DNA 会抑制某些酶的切割效率。

    关于甲基化更多信息请登陆 www. neb- china.com 及
    www.neb.com。

缓冲液

•  使用终浓度为 1X 的缓冲液。

•  BSA 已被添加到 NEB 缓冲液 1.1、1.2、1.3 和 CutSmart 缓冲液中，无需额外添加 BSA。

•  在不需要 BSA 即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入 BSA 也不会影响酶切效果。

反应体系

•  建议在 50 μl 反应体系中消化 1 μg 底物 DNA。

•  加 入内切酶的量应不超过总体积的 10%，以避免甘油过量引起的星号活性。

•  内切酶贮存液中的添加物（如：甘油和盐）和底物溶液中尚存的残余物（如：盐、EDTA 或乙醇）会导致小体 积反应出现问题。下述为小体积反应技术指南。

酶切反应体系的选择

* 当内切酶用量小时，用推荐稀释液稀释后使用。

**使用 10 μl 反应体系时，温育时间不要超过 1 小时，以防蒸发。

 温育时间

•  标准体系温育 1 小时，省时酶切体系温育 5-15 分钟。

•  使用省时内切酶。

•  许多内切酶都可以用更少单位的酶消化16小时。详情请登陆 www.neb-china.com 及 www.neb.com。

终止反应

若消化后的 DNA 不需要进行后续实验操作：

•  用终止液终止反应 [50% 甘油、50 mM EDTA（pH 8.0）和 0.05% 溴酚蓝]（如 NEB #B7021）。按每 50 μl反应体系中加入 10 μl 的比例进行。

若消化后的 DNA 需要进行后续实验操作：

•  用 热失活法（参见 2013﹒2014 商品目录 278-283 页或登陆 www.nebchina.com 及 www.neb.com，以确定该酶能否热失活）。

•  若该酶不能热失活，利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。

贮存

• 大多数内切酶建议保存在 -20℃。只有少数内切酶若贮存时间超过30 天建议保存在 -70℃。
  详细的贮存信息请参阅 www.neb.com 及 www.neb-china.com。

• 10X NEBuffer 也应保存在 -20℃。

稳定性

•  NEB 每 4 个月都会对所有的内切酶进行活性检测。使用期限标注在每管产品的标签上。

•  在任何情况下，都应尽可能的避免将酶置于高于 -20℃ 的温度下。

对照反应

如果在切割底物 DNA 时遇到了问题，建议加入以下对照实验：

•  酶切对照 DNA（含有多个已知内切酶切割位点的 DNA，如 Lambda DNA 或腺病毒-2 DNA），以检测内切酶的活性。

•  如果对照 DNA 能够被切割而实验中的底物 DNA 不能，可以将这两种 DNA 混合在一起再进行酶切，以检测实验用的底物 DNA 中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子（通常为盐、EDTA 或酚），则混合之后对照 DNA 也不能被切割。

星号活性

•  当内切酶在非最适条件下使用时可能会产生星号活性（详细信息请参考 2013﹒2014 商品目录 285 页内
   容）。

•  可以通过以下方法降低星号活性：使用高保真（HF）内切酶

双酶切反应         

使用两种限制性内切酶同时切割一种底物 DNA（双酶切反应）是一种常见的省时方案。超过 200 种的限制性内切酶在CutSmart^TM 反应缓冲液中有 100% 的活性，这使得双酶切反应更加简便。如果您使用的限制性内切酶提供的不是CutSmart^TM 反应缓冲液，请参考限制性内切酶的活性表（参考 2013﹒2014 商品目录 278-283 页），它列出了每一种限制性内切酶在四种标准反应缓冲液中的活性。

双酶切反应体系的建立

•  CutSmart 限制性内切酶的双酶切可以在CutSmart 反应缓冲液中进行。否则，选择两种酶都有活性的反应缓冲液进行双酶切反应。如果担心有星号活性，建议使用高保真（HF）限制性内切酶。

•  按推荐条件建立反应体系。反应体系中甘油的终浓度应＜ 5%，以避免星号活性（见 2013﹒2014 商品目录 285 页）。例如，50 μl 反应体系中总酶量 ≤ 5 μl。

•  如果需要两种不同温育温度，先选择合适的反应缓冲液，加入第一种酶在适合的温度下反应，热失活第一种酶后再加入第二种酶按推荐温度温育。

•  非最佳反应缓冲液中反应时，适当调整酶量和反应时间，以期克服非最佳反应条件带来的不利因素。

使用特殊缓冲液时双酶切体系的建立（特殊缓冲液代号为“U”）

•  NEB 目前有三种限制性内切酶提供特殊缓冲液：EcoRI、SspI 和 DpnII。在大部分情况下，DpnII 需要进行分步酶切。请注意 EcoRI 有 HF 形式的高保真酶，是提供 CutSmart 缓冲液的。

分步酶切体系的建立

•  如果没有一个共同的缓冲液使得两种限制性内切酶的活性均大于 50%，就需要进行分步酶切。

•  分步酶切应从推荐缓冲液盐浓度低的酶开始，温育至酶切完毕。

•  调整缓冲液中盐浓度（用小体积浓缩盐溶液）直至满足第二种酶的要求。

•  加入第二种酶完成双酶切反应。

•  也可在第二步酶切反应前过柱纯化 DNA。

实验问题指南