IF 实验操作步骤
IF 实验操作步骤
*重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于IF-IC、IF-F或IF-P实验。以下分别提供实验步骤。
一. Cultured Cells ( Immunocytochemistry, IF-IC ) Protocol
细胞系培养物来源（IF-IC）
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。
A.所需溶液和试剂
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (#9808) : 配制 1L 的 1xPBS，50mL 20xPBS 与 950mL 蒸馏水混匀，调整PH至8.0。
注：1xPBS配方。3.2mM 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) ，0.5mM 磷酸二氢钾 (KH2PO4)，1.3mM 氯化钾(KCl)，135mM 氯化钠 (NaCl)，PH7.4。
2. 16%甲醛溶液，无甲醇： Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。
3. 封闭缓冲液（1xPBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100）：配制 10ml，0.5mL 正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驴血清）和 0.5mL 20xPBS 兑到 9mL 蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入30µL Triton X-100(100%)。
4. 抗体稀释缓冲液（1xPBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100）： 配制 10mL 时，取 30µL Triton X-100 加入到 10mL 1 X PBS 中，混匀后加入 0.1g BSA(#9998) ，混匀至全部溶解。
5. 荧光素标记的二抗(每个产品的网页中有推荐的二抗)
6.封片剂：Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的二抗时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低。
B.样品制备
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。
注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。
1. 用PBS稍加润洗。
2. 吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（用1xPBS配制）中。
注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。
3. 室温下固定细胞15分钟。
4. 吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。
5. 继续C部分的免疫染色。
C.免疫染色
注意：以下所有的孵育过程，除特殊说明外，需要在室温下的避光湿盒中进行，以免切片变干和荧光淬灭。
1. 将样品在封闭液中封闭60分钟。
2. 封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
3. 吸去封闭液，加入稀释的一抗。
4. 在4°C孵育过夜。
5. 吸弃一抗，用PBS润洗3次，每次5分钟。
可选：为降低背景，在第2次PBS润洗和第3次BS润洗之间可增加高盐PBS润洗2分钟的步骤。但也要注意，这一步可能会降低一些抗体的特异信号。
注意：如果所用一抗直接标记有Alexa Fluor®荧光素，则直接跳到C8步。
6. 把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的，将样品与稀释抗体在室温下避光孵育1-2小时。
注意：在做双染时，将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
7. 按第5步用PBS/高盐PBS润洗切片。
8. 涂上Prolong® Gold 抗淬灭试剂后盖上玻片。处理多孔板时，抗淬灭试剂盖住细胞细胞即可。
9. 在盖玻片的周围涂上指甲油密封。
10. 立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。如果要长期保存，将玻片放在4°C避光保存。
二. Frozen/Cryostat Tissue Sections ( IF-F) Protocol
冰冻组织切片（IF-F）
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。
A.所需溶液和试剂
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (#9808) : 配制 1L 的 1xPBS，50mL 20xPBS 与 950mL 蒸馏水混匀，调整PH至8.0。
注：1xPBS配方。3.2mM 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) ，0.5mM 磷酸二氢钾 (KH2PO4)，1.3mM 氯化钾(KCl)，135mM 氯化钠 (NaCl)，PH7.4。
2. 16%甲醛溶液，无甲醇： Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。
3. 封闭缓冲液（1xPBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100）：配制 10ml，0.5mL 正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驴血清）和 0.5mL 20xPBS 兑到 9mL 蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入30µL Triton X-100(100%)。
4. 抗体稀释缓冲液（1xPBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100）： 配制 10mL 时，取 30µL Triton X-100 加入到 10mL 1 X PBS 中，混匀后加入 0.1g BSA(#9998) ，混匀至全部溶解。
5. 荧光素标记的二抗(每个产品的网页中有推荐的二抗)
6.封片剂：Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的二抗时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低。
B.样品制备
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-F。
注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。
I. 对固定好的冰冻组织，在工作台上风干 10 分钟，然后继续 C 部分的免疫染色。
II. 对新鲜未固定的组织，立即按照以下步骤固定：
1. 用 PBS 配置的 2-4% 甲醛溶液浸泡组织切片。
注意：甲醛有毒，这一步需要在通风橱中进行。
2. 室温下固定细胞15分钟。
3. 吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。
4. 继续C部分的免疫染色。
C.免疫染色
注意：以下所有的孵育过程，除特殊说明外，需要在室温下的避光湿盒中进行，以免切片变干和荧光淬灭。
1. 将样品在封闭液中封闭60分钟。
2. 封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
3. 吸去封闭液，加入稀释的一抗。
4. 在4°C孵育过夜。
5. 吸弃一抗，用PBS润洗3次，每次5分钟。
可选：为降低背景，在第2次PBS润洗和第3次BS润洗之间可增加高盐PBS润洗2分钟的步骤。但也要注意，这一步可能会降低一些抗体的特异信号。
注意：如果所用一抗直接标记有Alexa Fluor®荧光素，则直接跳到C8步。
6. 把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的，将样品与稀释抗体在室温下避光孵育1小时。
注意：在做双染时，将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
7. 按第5步用PBS/高盐PBS润洗切片。
8. 涂上Prolong® Gold 抗淬灭试剂后盖上玻片。处理多孔板时，抗淬灭试剂盖住细胞细胞即可。
9. 在盖玻片的周围涂上指甲油密封。
10. 立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。如果要长期保存，将玻片放在4°C避光保存。
三. Paraffin Tissue Sections ( IF-P) Protocol
石蜡组织切片（IF-P）
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。
A.所需溶液和试剂
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 二甲苯
2. 无水乙醇，组织学级（100%和95%）
3. 抗原暴露：
a. 10mM 柠檬酸钠缓冲液：配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7•2H2O)溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。
b. 1mM EDTA：配置1L时，称取0.372g EDTA(C10H14N2O8Na2•2H2O)溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。
4. 10 x TBST(#9997)：配制 1 x TBST 时，取100mL 10 x TBST 加入到 900mL 蒸馏水中，混匀。
5. 孵育缓冲液（1xTBST / 5% normal serum ）：配制10mL，0.5mL 正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驴血清）和 9.5mL 1xTBST，混匀。
6. 荧光素标记的二抗(每个产品的网页中有推荐的二抗)
7.封片剂：Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
B.脱蜡处理/再水化
注意：在此过程中要避免组织切片干燥。
1. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。
2. 用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。
3. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟
4. 在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。
C.抗原暴露
注意：请参照产品说明书中具体的抗原暴露操作的建议。
1. 室温下，将切片泡在10 mM柠檬酸盐缓冲液中（pH 6.0.）。
2. 用水浴锅或是微波炉加热泡在柠檬酸盐缓冲液中的玻片使之接近沸腾，保持95-99°C约10分钟。
3. 取出玻片，放在实验台上自然冷却30分钟。
4. 在蒸馏水中润洗3次，每次5分钟。
5. 在PBS中润洗5分钟。
6. 继续C部分的免疫染色。
D.免疫染色
注意：以下所有的孵育过程，除特殊说明外，需要在室温下的避光湿盒中进行，以免切片变干和荧光淬灭。
1. 用 1xTBST 洗切片3次，每次5分钟。
2. 将样品在封闭液中封闭60分钟。
3. 封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
4. 吸去封闭液，加入稀释的一抗。
5. 在4°C孵育过夜。
6. 吸弃一抗，用PBS润洗3次，每次5分钟。
可选：为降低背景，在第2次PBS润洗和第3次BS润洗之间可增加高盐PBS润洗2分钟的步骤。但也要注意，这一步可能会降低一些抗体的特异信号。
注意：如果所用一抗直接标记有Alexa Fluor®荧光素，则直接跳到D9步。
7. 把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的，将样品与稀释抗体在室温下避光孵育1小时。
注意：在做双染时，将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
8. 按第5步用PBS/高盐PBS润洗切片。
9. 涂上Prolong® Gold 抗淬灭试剂后盖上玻片。处理多孔板时，抗淬灭试剂盖住细胞细胞即可。
10. 在盖玻片的周围涂上指甲油密封。
11. 立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。如果要长期保存，将玻片放在4°C避光保存。
推荐的二抗
Anti-Rabbit
抗兔：
1. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®488 Conjugate) #4412
2. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®555 Conjugate) #4413
3. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®647 Conjugate) #4414
4. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (DyLight™ 488 Conjugate) #4315
Anti-Mouse
抗小鼠：
1. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®488 Conjugate) #4408
2. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®555 Conjugate) #4409
3. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor®647 Conjugate) #4410
4. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (DyLight™ 488 Conjugate) #4316
Anti-Rat
抗大鼠：
1. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4416
2. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4417
3. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4418
