WB 实验操作步骤

A. 溶液和试剂

从样品制备到检测，您进行蛋白质印迹法时所需要的试剂现均包含在一个便利的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

了解我们的溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。

2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：( #12498) 要制备 1 L 1X TBS：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X，然后混匀。

3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#77227723) 或Red Loading Pack (#) ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 电泳缓冲液，然后混匀。

5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：( #12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。

6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：( #9997) 要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。

7. 脱脂奶粉：(#9999)。

8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。

9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。

1.     牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。

2.     一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。

12. 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727)。

13. 预染蛋白质标准品，宽范围 (11-190 kDa)：(#13953)。

14. 印迹膜和纸：(#12369) 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。

15. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠(#7076)。

16. 检测试剂：LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

 B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

样品制备、SDS-PAGE 和转移

1. 添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。

2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。

3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞（6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl）。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。

6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 取20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

注：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (#7727，10 µl/泳道）上样以确定分子量。

1. 电转移至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

封闭和抗体孵育

注：以下所用试剂体积数适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整体积。

I. 膜封闭

1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

2. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

II.一抗孵育

根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

对于无偶联的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000），同时加入anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075 ，按 1: 1000-1:3000）以检测生物素化的蛋白质标准品。置于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

1. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

2. 继续进行检测（D 部分）。

对于偶联有HRP 的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

3. 与检测生物素酰化蛋白质标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075 ，按 1: 1000-1:3000）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

1. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

2. 继续进行检测（D 部分）。

对于生物素化的一抗

1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

将膜与 Streptavidin-HRP （#3999 以适宜的稀释度）在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。

1. 用 5 ml TBST 洗涤三次，每次 15 分钟。

2. 继续进行检测（D 部分）。

3. 请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

 D. 蛋白质检测

蛋白质检测

1. 将膜与 10 ml LumiGLO®（0.5 ml 20X LumiGLO® #7003、0.5 ml 20X 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温下孵育1 分钟并不时轻轻搅动。

2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光时间中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的 2 小时内会减弱。

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 本文来自CST博士互助平台