免疫组化方法（石蜡切片）

*重要提示：参考抗体说明书选用合适的抗体稀释液和抗原修复处理方法。IHC方法：抗原修复缓冲液/抗体稀释液

A.     所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3. 去离子水（dH₂O）

4. 苏木精（可选）

5. 漂洗（缓冲）液：

1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)：配制时，取100 ml 10X TBS加900 ml水稀释至1升。加入1 ml Tween-20，混匀。

10X Tris缓冲盐水(10X TBS)：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base, C₄H₁₁NO₃）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6，定容至1 L。

6. *抗体稀释液

a. SignalStain^® 抗体稀释液 #8112

b. TBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X TBST 中添加250 µl正常山羊血清。

c. PBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X PBST 中添加250 µl正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制时，取100 ml 10X PBS加900 ml水稀释至1 L。加入1 ml Tween-20，混匀。

10X 磷酸盐缓冲液 (10X PBS): 在800 ml水中加入80 g 氯化钠（NaCl）, 2 g 氯化钾（KCl）, 14.4 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和2.4 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。调整pH到7.4，定容至1 L。

7. *抗原修复：

a. 柠檬酸盐：10 mM柠檬酸盐缓冲液：称取2.94g二水合柠檬酸钠（C₆H₅Na₃O₇•2H₂O）溶解在800 ml水中。调整pH为6.0，定容至1 L。

b. EDTA: 1mM EDTA: 称取0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 溶解在800 ml水中。调整pH为8.0，定容至1 L。

c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制时，称取1.21 g Trizma^®碱（C₄H₁₁NO₃）和0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 溶解在950 ml蒸馏水中。调整pH到9.0，然后用蒸馏水定容至到1 L。

d. 胃蛋白酶：1 mg/ml，溶解在pH为2.0的Tris盐酸缓冲液中。

8. 3%过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H₂O₂加入到90 ml蒸馏水中。

9. 封闭液：TBST/5%正常山羊血清：5 ml 1X TBST中添加250 µl正常山羊血清。

10. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统：

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125

注意: 如果本产品没有使用本试剂优化过，可能需要通过滴定法来确定最佳条件。

11. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

 

B.      脱蜡处理/再水化

注意：操作中任何时候都不要晾干玻片

1. 脱蜡处理/切片的水化：

a.       用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。

b.       用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。

c.       用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟

2. 在蒸馏水中漂洗2次，每次5分钟。

 C.     *抗原修复

注意：参考抗体说明书选用合适的抗原修复缓冲液，按以下步骤操作。

1. 柠檬酸缓冲液处理：加热浸泡在10 mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）10分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。

2. EDTA处理：加热浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）15分钟。不需另加冷却步骤。

3. TE处理：加热浸泡在pH 9.0的10 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片，使之维持在准沸腾的温度（95-99°C）18分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。

4. 胃蛋白酶处理：37°C消化10分钟。

 D.     染色

注意：查询产品说明书推荐的抗体稀释比例。

1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。

2. 浸泡在3% H₂0₂中孵育10分钟

3. 用蒸馏水漂洗两次，每次5分钟。

4. 用漂洗液洗5分钟

5. 在切片上滴加100-400 μl封闭液，室温封闭1小时。

6. 去掉封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7. 去掉抗体稀释液。用漂洗液洗3次，每次5分钟。

8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统检测。

9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。

10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。

14. 切片脱水：

a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。

b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。

15. 加上盖玻片。

 

免疫组化方法（冰冻切片）

A.     所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）

3. 苏木精（可选）

4. 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a. 10%中性福尔马林

b. 丙酮

c. 甲醇

d. 3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。

5. 10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C₄H₁₁NO₃）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。

6. 漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7. 甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H₂0₂加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。

8. 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

9. 检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。

10. DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

 

B.      切片

1. 对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。

2. 将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）

 C.     固定

注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂

1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a. 10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。

b. 冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。

c. 甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。

d. 3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。

e. 3% 甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。立即进行染色操作。

 D.     染色

1. 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。

2. 室温下，浸泡在3% H₂0₂/甲醇中孵育10分钟

3. 用漂洗液洗两次，每次5分钟。

4. 在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。

5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6. 去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次，每次5分钟。

8. 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。

9. 用漂洗液洗3次，每次5分钟。

10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。

14. 切片脱水：

a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。

b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒。

15. 加上盖玻片。

 

*已有的检测系统：

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125