Dam (G^mATC), Dcm (C^mCWGG) 和 CpG (^mCG) 甲基化             

DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，它能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或胞嘧啶上。当使用限制性内切酶消化 DNA 时，要考虑 DNA 是否有甲基化的问题，因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。

原核生物甲基化

在原核生物中，DNA 甲基转移酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌表达三种位点特异性的 DNA 甲基转移酶。

• Dam 甲基转移酶能将甲基转移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N⁶ 位点上（1,2）。

• Dcm 甲基转移酶能在 CCAGG 和 CCTGG（1,3）序列内部的胞嘧啶 C⁵ 位置上甲基化。

• EcoKI 甲基转移酶可将 AAC (N⁶A) GTGC 和 GCAC (N⁶A) GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。

如果限制性内切酶的切割对象是从表达 Dam 或 Dcm 甲基转移酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能被阻断。例如，从 dam⁺ E. coli 中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的 MboI 所切割。

E. coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全甲基化（因此完全不能被 MboI 切割)，而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λ DNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的内切酶只能对这些 λ DNA 进行部分切割。

被 Dam 或 Dcm 甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去甲基化，即将 DNA 转至 dam^-/dcm^-  菌株中进行繁殖 [如 dam^- /dcm^- E. coli 感受态细胞（NEB #C2925）]。

如果出现重叠位点，内切酶酶切也会被阻断。在这种情况下，Dam 或者 Dcm 序列一部分来自内切酶识别序列，另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计内切酶酶切时也应考虑到这种情况。

真核生物甲基化

在高等真核生物（如 Dnmt1）中发现的 CpG 甲基转移酶（CpG MTases），能将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的 C⁵ 位点。CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测CpG 甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用（4）。

注意：在消化真核基因组 DNA 时尤其要关注 CpG 甲基化的影响。需要注意的是，一旦 DNA 被克隆到细菌中后，将不存在 CpG 甲基化形式。

甲基化敏感性

下表总结了NEB 限制性内切酶的甲基化敏感性，表中列出了内切酶识别位点被 Dam、Dcm或 CpG 甲基化后内切酶的切割是否被阻断或消弱。本表只对酶的特性提供参考信息，不能作为绝对依据。若想了解更多详细信
息以及本指南所基于的特定例子，请登陆限制性内切酶 REBASE 数据库
( http://rebase.neb.com/rebase/ )。 

 参考文献：

(1) Marinus, M.G. and Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol.,114, 1143–1150.

(2) Geier, G.E. and Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem.,254, 1408–1413.

(3) May, M.S. and Hattman, S. (1975) J. Bacteriol.,123, 768–770.

(4) Siegfried, Z. and Cedar, H. (1997) Curr. Biol., 7,r305–307.