SNAP-tag^® 标记技术问题解答               

 细胞显像和分析常见问题解答

Q. 使用 SNAP-tag^® 标记和 GFP 融合蛋白标记有何不同？

A. GFP 和 SNAP-tag 都是在活细胞内可视化蛋白的有效技术。GFP 是来源于 Aequorea victoria 的荧光蛋白，而SNAP-tag 来源于人 DNA 修复蛋白 hAGT。与 GFP 不同，欲荧光标记与 SNAP-tag 相融合的蛋白，只需在培养基中直接加入各种荧光探针即可。更换不同荧光或者其它功能基团（生物素、磁珠或阻断剂）时，也无需重新克隆和表达，只要将细胞、细胞裂解物或重组蛋白与需要更换的底物孵育即可。

Q. SNAP- 和 CLIP-tag^™ 有何不同？

A. SNAP-tag 和 CLIP-tag 均来源于人 DNA 修复蛋白 hAGT。SNAP-tag 识别 O⁶-标记的苄基鸟嘌呤底物（benzylguanine）而 CLIP-tag 识别 O²-标记的苄基胞嘧啶底物（benzylcytosine）。两种tag均能将标记物转移到自身形成特异性的共价结合标记。hAGT 经基因工程改造后不再与 DNA 作用，而与苄基鸟嘌呤和苄基胞嘧啶的衍生物结合。两种 Tag 之间无交叉反应，因此可以在活细胞内用不同荧光基团同时标记含 SNAP- 和 CLIP- 的融合蛋白。

Q. 蛋白质能融合表达在 tag 的 N 端或 C 端吗？

A. 能。SNAP- 和 CLIP-tag 都能融合表达在目的蛋白的 N 端或 C 端。但是，选用 ACP 或 MCPtag 标记细胞外表面蛋白时，tag 的克隆方向必须是在细胞膜外的部分，这样才能与相应的底物进行反应。

Q. 底物对细胞有毒性吗？

A. 在底物浓度高达 20 μM 时，细胞与底物孵育 2 小时，未见对细胞的增殖和生长有毒性作用。大多数底物在 20 μM 浓度下与细胞孵育 24 小时未见明显毒性。

Q. 标记蛋白在哺乳动物细胞内的稳定性？

A. 标记蛋白在细胞内的稳定性取决于目的蛋白的稳定性。标记 SNAP-tag 的融合蛋白在哺乳动物细胞内 2 天后仍然能被检测到。

Q. SNAP-tag 的底物在固定过程中是否稳定？

A. 稳定。SNAP-tag 的底物荧光来源于有机荧光基团，因此标记的 SNAP-tag 融合蛋白在固定过程中表现非常稳定，不会损失信号强度，这点与某些 GFP 发生光谱变异不同。SNAP-tag 融合蛋白标记后，细胞用常用方法固定如：多聚甲醛、乙醇、甲醇以及甲醇/丙酮等，都不会降低信号强度。

Q. 体内标记 SNAP-tag 的推荐反应条件？

A.SNAP-tag 标记反应可在多种缓冲液中进行。选择何种缓冲液取决于被融合蛋白的要求。下面是推荐的缓冲液选择指南：pH 5.0-10.0，单价盐（如 NaCl）50 mM-250 mM，以及至少 1 mM 的 DTT。如果需要可加入 0.5%v/v 的非离子型变性剂，但是应绝对避免使用 SDS 和其它离子变性剂，因为它们会抑制 SNAP-tag 的活性。金属离子螯合剂（如 EDTA 和 EGTA）同样会抑制 SNAP-tag 的活性，因此也不能使用。