美国Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技术作为新一代的RNA原位杂交技术，通过其专利的双Z探针设计原理以及信号级联放大系统，可以兼容由于空气中RNA酶对于RNA的部分降解导致一定程度的组织RNA缺损，从而达到对组织和细胞内的RNA进行高效的原位检测。

在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope对石蜡样本，新鲜冰冻和固定冰冻样本的组织切片进行原位杂交的过程中，经常会遇到各种各样的技术问题。本专题就一系列典型代表性的问题进行归类总结。本篇聚焦样本制备步骤，给大家提供一些相关小贴士。

对于RNAscope类实验的样本制备，说明书里有比较详细的说明。需要注意的事项有以下一些：

石蜡样本的制备中，在冰上取材后建议第一时间放入10%中性福尔马林固定液（10%NBF）浸泡16-32小时。固定液的体积建议至少是组织体积的10-20倍。充分固定组织样本是RNA原位检测的成败关键之一。经过充分固定的组织样本内的RNA可以与蛋白进行交联。从而达到最佳的保护效果。

对于新鲜冰冻样本制备，需要提前准备好冰冻包埋模具（如下图）以及倒入模具备用的OCT，以及盛有干冰的盒子或者-80℃冰箱。在组织取材时，在冰上将组织剥离后，切成适当大小后浸入预先倒入OCT的包埋模具中，之后快速将含有组织块和OCT包埋模具放入装有干冰的封闭盒子内或者直接放入-80℃冰箱。每个包埋模具浸入组织后第一时间放入干冰或者-80℃内进行冷冻保存。不建议积攒一批后再进行后续操作。组织样本要在干冰或者-80℃冰箱内至少过夜保存后再进行切片处理。

对于灌注固定的样本，建议客户使用新鲜配制的4%多聚甲醛（4%PFA）对动物进行灌注固定。组织取材后继续放入新鲜的4%多聚甲醛（4% PFA）在4℃进行固定24小时。之后依次浸入15%和30%的蔗糖溶液中（4℃）至样本沉入底部（依据样本大小不同时间不同）。此步可以保护组织细胞形态。之后将组织块浸入装有OCT的组织包埋盒内，放入-80℃冰箱至少过夜后在进行切片制备。此步有一个关键点即4%多聚甲醛的有效性问题。由于多聚甲醛属于强还原性试剂，故不像10%中性福尔马林固定液那样可以在室温长期保存。4%PFA会随着时间发生氧化，从而固定效果大打折扣。为了最大程度的维持4%PFA的固定效果，建议使用新鲜配制（当天配置）的4%PFA进行固定。如果当日不方便配置，可以事先配置好4%PFA，分装并直接冻在-20℃，使用前拿出一只融化后立即使用。

一般依据以上提示制备的组织石蜡块或者冰冻组织块，进行后续常规切片并相应的RNAscope, Basescope或者miRNAscope检测，组织样本可以通过质控（QC）检测，即阳性对照探针检测评分≧2，阴性对照为0。值得注意的是，石蜡块相较于冰冻组织块，可以更为长期的保存。经验证经过上述标准化固定5-10年的石蜡块在进行了石蜡切片后仍然可以通过RNAscope质控检测，并进行靶探针检测。值得注意的事，石蜡切片一旦切出来后，需要在2个月内完成实验。

除了常规组织样本外，有研究团队使用到1）微小组织样本，例如类器官，3D培养细胞团或者小型昆虫等样本；2）骨骼组织或软骨样本；3）血液样本进行RNAscope检测，这几类样本同样可以制备成石蜡块，并进行RNAscope检测。针对于这类样本的石蜡块制备流程，本公众号之前的有相关样本制备的软文参考。骨骼样本固定， 脱钙及制备方法请参见题目为：RNA原位检测中，骨和软骨样本制备处理技术浅谈及应用；微小样本制备请参见1）题目为：RNAscope技术在类器官中的应用举例以及类器官石蜡样本制备简介；以及2）题目为：在谈RNAscope技术与类器官的相关文章。更多类型样本制备，例如血液样本制备等问题可直接与我公司FAS团队或者通过本公众号联系询问。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：

应用广泛 

使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

特异性强

RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。

单分子可视化和单细胞定量

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。